Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật là một kỹ thuật nền tảng trong vi sinh học, cho phép nhân lên và duy trì quần thể vi sinh vật trong điều kiện kiểm soát để phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất hoặc kiểm nghiệm. Tùy vào mục đích sử dụng, phương pháp này có thể được thiết kế theo nhiều dạng khác nhau nhằm đảm bảo điều kiện tối ưu cho từng loài vi sinh vật cụ thể.
Nuôi cấy vi sinh vật dựa trên nguyên lý cung cấp môi trường dinh dưỡng thích hợp, cùng với nhiệt độ, pH, độ ẩm, và khí hậu vi sinh (aerobic hoặc anaerobic) phù hợp với đặc tính sinh trưởng của từng loại vi sinh vật. Việc kiểm soát những yếu tố này là điều kiện tiên quyết để vi sinh vật phát triển ổn định và chính xác, từ đó phục vụ hiệu quả cho các mục đích nghiên cứu hoặc ứng dụng.
2.1. Theo dạng môi trường
– Nuôi cấy trên môi trường rắn: sử dụng môi trường chứa thạch (agar) để định hình và tách lập vi sinh vật. Dạng này thường dùng để đếm khuẩn lạc, phân lập hoặc định danh.
– Nuôi cấy trên môi trường lỏng: dành cho việc nhân sinh khối, nghiên cứu sinh lý, enzyme, độc tố, hoặc lên men.
2.2. Theo kỹ thuật nuôi cấy
– Nuôi cấy không liên tục (batch culture): hệ thống đóng, không bổ sung chất dinh dưỡng hay loại bỏ sản phẩm sau khi bắt đầu nuôi. Phù hợp cho nghiên cứu chu kỳ sống của vi sinh vật.
– Nuôi cấy liên tục (continuous culture): hệ thống mở, thường sử dụng trong công nghiệp để thu nhận sản phẩm ổn định theo thời gian dài (ví dụ: lên men ethanol, sản xuất enzyme).
– Nuôi cấy bán liên tục (fed-batch culture): bổ sung dinh dưỡng dần theo thời gian, thường dùng khi cần điều chỉnh tốc độ tăng trưởng hoặc năng suất sản phẩm.
– Thành phần môi trường: mỗi loại vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng khác nhau (nguồn carbon, nitơ, vi lượng…).
– pH và nhiệt độ: mỗi loài có giá trị tối ưu riêng, ví dụ: vi khuẩn ưa nhiệt cần 50-60°C, nấm men ưa môi trường axit nhẹ.
– Oxy: vi khuẩn hiếu khí cần thông khí tốt; ngược lại, vi khuẩn kỵ khí cần môi trường không có oxy (dùng bình kỵ khí hoặc môi trường khử).
– Thời gian và tốc độ sinh trưởng: tùy thuộc vào giai đoạn cần nghiên cứu (giai đoạn log, stationary…) để quyết định thời gian nuôi cấy phù hợp.
4.1. Chuẩn bị mẫu
– Lấy mẫu: lấy mẫu thực phẩm theo quy định, đảm bảo đại diện và không làm ô nhiễm mẫu.
– Pha loãng mẫu: mẫu thực phẩm thường được pha loãng theo tỷ lệ xác định (ví dụ: 1:10) bằng dung dịch pha loãng đệm để dễ dàng phân tích.
4.2. Chọn môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy được chọn tùy thuộc vào loại vi sinh vật cần phát hiện:
– Tổng số vi sinh vật hiếu khí: môi trường PCA (Plate Count Agar).
– Coliform: môi trường VRBA (Violet Red Bile Agar) hoặc Compact Dry EC.
– Nấm men, nấm mốc: môi trường PDA (Potato Dextrose Agar).
– Môi trường kỵ khí: môi trường đặc biệt không chứa oxy, ví dụ Thioglycollate Agar.
4.3. Kỹ thuật nuôi cấy
– Phương pháp trải đĩa (Spread Plate): dùng que trải mẫu đã pha loãng lên bề mặt môi trường nuôi cấy.
– Phương pháp đổ đĩa (Pour Plate): trộn mẫu với môi trường lỏng (agar) và để đông đặc.
– Phương pháp màng lọc (Membrane Filtration): lọc mẫu qua màng lọc, sau đó đặt màng lên bề mặt môi trường nuôi cấy.
– Đĩa Compact Dry: sử dụng đĩa khô chuyên dụng đã chứa môi trường nuôi cấy sẵn, như Compact Dry TC, Compact Dry YM.
4.4. Điều kiện ủ
– Nhiệt độ: tùy loại vi sinh vật (ví dụ: 35-37°C cho vi khuẩn, 25-30°C cho nấm men, nấm mốc).
– Thời gian: thường từ 24 đến 72 giờ, tùy vào loại vi sinh vật.
4.5. Đếm khuẩn lạc và kết quả
– Đếm số khuẩn lạc trên đĩa và tính mật độ vi sinh vật dựa trên thể tích mẫu cấy.
– Công thức tính
4.6.Xác định đặc điểm vi sinh vật
– Hình thái khuẩn lạc: quan sát màu sắc, hình dạng khuẩn lạc.
– Xét nghiệm bổ sung: thực hiện nhuộm Gram, phân tích enzym, hoặc PCR để định danh chi tiết vi sinh vật.
– Trong y học: phát hiện, định danh và kiểm tra kháng sinh đồ của các vi sinh vật gây bệnh.
– Trong công nghiệp thực phẩm: sản xuất rượu, bia, sữa chua, enzyme và acid hữu cơ (acid lactic, citric…)
– Trong nông nghiệp: nhân nuôi vi sinh vật phân giải lân, cố định đạm hoặc ức chế mầm bệnh trong đất.
– Trong kiểm nghiệm vi sinh: đánh giá độ an toàn thực phẩm, nước uống, mỹ phẩm và dược phẩm.
– Vô trùng là điều kiện đặc biệt: toàn bộ dụng cụ, môi trường, tay người thao tác đều cần vô trùng để tránh nhiễm tạp.
– Lựa chọn môi trường phù hợp: mỗi loại vi sinh vật cần được nuôi trong điều kiện tối ưu để phát triển chính xác.
– Đọc kết quả đúng cách: việc nhận biết hình thái khuẩn lạc, màu sắc môi trường thay đổi hay đặc tính sinh hóa là những yếu tố quan trọng trong phân tích.
Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật là một kỹ thuật cốt lõi trong nhiều ngành khoa học và ứng dụng. Việc nắm vững nguyên lý, phân loại và điều kiện nuôi cấy không chỉ giúp xác định chính xác vi sinh vật mà còn nâng cao hiệu quả trong sản xuất và kiểm nghiệm. Với sự phát triển của công nghệ, các phương pháp nuôi cấy ngày càng được tối ưu hóa để phục vụ tốt hơn cho y học, công nghiệp và môi trường.