Trong lĩnh vực sinh học phân tử, quá trình khuếch đại axit nucleic là nền tảng cho các ứng dụng nghiên cứu và chẩn đoán. Hiện nay, PCR là phương pháp khuếch đại axit nucleic phổ biến nhất. Tuy nhiên, kĩ thuật PCR đòi hỏi thiết bị luân nhiệt chuyên dụng nhằm tạo ra các chu kì nhiệt. Do đó, phương pháp này không có tính ứng dụng cao trong thực tiễn hoặc những khu vực thiếu máy luân nhiệt.
Nhu cầu sử dụng kĩ thuật khuếch đại đẳng nhiệt ngày càng tăng. Vì vậy, kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn (Rolling Circle Amplification – RCA) ra đời như một phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt tiên phong. Kĩ thuật này sử dụng ADN khuôn mẫu dạng vòng tròn, qua đó cho phép tổng hợp liên tục các bản sao ADN tại nhiệt độ không thay đổi.
Kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn là gì?
Kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn bắt nguồn từ quá trình sao chép ADN dạng vòng trong tự nhiên. Những năm đầu thập niên 90, các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu khả năng khuếch đại ADN khi sử dụng khuôn mẫu là các phân tử ADN vòng có kích thước nhỏ. Năm 1992, các thí nghiệm đã chứng minh enzyme ADN polymerase có thể tổng hợp ADN mới từ các khuôn mẫu ADN vòng nhỏ này, qua đó tạo ra những mạch ADN dài chứa nhiều bản sao liên tiếp. Phát hiện này đã mở ra một hướng mới trong lĩnh vực khuếch đại axit nucleic. Đến năm 1995, nghiên cứu của Andrew Fire và cộng sự về khả năng khuếch đại các phân tử ADN dạng vòng nhỏ đã đặt nền móng cho kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn.
Trong những năm gần đây, kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn liên tục được cải tiến với nhiều phiên bản nâng cấp của kĩ thuật này ra đời. Những cải tiến này tăng hiệu suất khuếch đại lên nhiều lần, đồng thời mở rộng phạm vi ứng dụng. Kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn ngày càng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chẩn đoán phân tử, công nghệ nano và quan trắc môi trường.
Thành phần tham gia kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn
Kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn yêu cầu bốn thành phần chính để thực hiện phản ứng khuếch đại. Chúng bao gồm.
Enzyme ADN polymerase
Kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn sử dụng enzyme Phi29 ADN polymerase có khả năng tổng hợp mạch dài liên tục và đẩy mạch ADN. Ngoài ra, enzyme này có thể hoạt động trên các ADN khuôn mẫu dạng vòng phức tạp có cấu trúc nút thắt và nhiều điểm giao nhau.
Mồi ADN hoặc ARN
Đoạn ADN hoặc ARN ngắn được sử dụng như điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp ADN. Đoạn mồi này gắn vào vòng ADN mẫu và cung cấp điểm bắt đầu cho ADN polymerase bám vào và tổng hợp sợi ADN mới.
ADN vòng khuôn mẫu
ADN vòng khuôn mẫu là phân tử ADN dạng vòng có độ dài khoảng 15-200 nucleotide. Các vòng ADN này được tạo ra bằng cách sử dụng liên kết enzyme có khuôn mẫu (như T4 ADN ligase) hoặc liên kết enzyme không khuôn mẫu với các ADN ligase đặc biệt như CircLigase.
dNTPs
dNTPs là các nucleotide tự do gồm A, T, G và C. Chúng cung cấp nguyên liệu để tổng hợp mạch ADN mới.
Cơ chế hoạt động của kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn
Giai đoạn 1. Tạo khuôn mẫu dạng vòng
Trước khi bắt đầu phản ứng kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn, bước quan trọng đầu tiên là tạo ADN khuôn mẫu dạng vòng. Quá trình này có thể thực hiện theo hai phương pháp.
Tạo vòng có ADN khuôn
Phương pháp tạo vòng có ADN khuôn sử dụng enzyme T4 ADN ligase và ADN bổ sung làm khuôn. ADN khuôn giúp kéo hai đầu của đoạn ADN cần nối (15-200 nucleotide) về gần nhau thông qua bắt cặp bổ sung. Sau đó, enzyme T4 ADN ligase xúc tác phản ứng tạo liên kết phosphodiester giữa đầu 5′-phosphate và 3′-hydroxyl để hình thành cấu trúc ADN vòng hoàn chỉnh.
Tạo vòng không có ADN khuôn
Tạo vòng không có ADN khuôn sử dụng enzyme CircLigase. Enzyme này có khả năng nối trực tiếp hai đầu của một mạch ADN đơn mà không cần ADN khuôn hỗ trợ. Enzyme này nhận diện và nối đầu 5′-phosphate với đầu 3′-hydroxyl trên cùng một mạch ADN, qua đó tạo thành cấu trúc vòng.
Trong trường hợp ADN mẫu có sẵn dạng vòng như plasmid, ADN ti thể hoặc ADN của virus, không cần phải thực hiện bước tạo vòng này.
Giai đoạn 2. Quá trình khuếch đại
Sau khi có khuôn mẫu dạng vòng, phản ứng khuếch đại vòng tròn lăn bắt đầu với các thành phần sau.
Mồi
Một đoạn oligonucleotide ngắn (ADN hoặc RNA) lai với vùng bổ sung trên khuôn mẫu vòng, tạo điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp ADN mới.
Enzyme Phi29 ADN polymerase
Enzyme này có hai tính chất quan trọng là khả năng tổng hợp mạch ADN dài liên tục và khả năng đẩy mạch ADN đã tổng hợp ra khỏi khuôn. Sau khi nhận diện điểm khởi đầu từ đoạn mồi, enzyme bắt đầu tổng hợp mạch ADN mới theo chiều 5′ → 3′ bằng cách sử dụng các dNTP tự do trong môi trường phản ứng.
Do ADN khuôn mẫu có dạng vòng, enzyme có thể tổng hợp liên tục quanh vòng mà không gặp điểm kết thúc. Đồng thời, enzyme này có khả năng đẩy mạch nên các mạch ADN mới tổng hợp liên tục được đẩy ra để giải phóng khuôn cho chu kì tổng hợp tiếp theo. Sau khi kết thúc phản ứng, một mạch ADN dài chứa nhiều bản sao liên tiếp của trình tự gốc được tạo ra.
Toàn bộ quá trình diễn ra tại nhiệt độ ổn định (30-37°C) và không đòi hỏi chu kì luân nhiệt như PCR. Tính chất này giúp đơn giản hóa quy trình thực hiện, đồng thời cho phép tích hợp phản ứng khuếch đại vòng tròn lăn với các phản ứng sinh hóa khác hoặc thực hiện trực tiếp trong tế bào sống.
Nhận biết sản phẩm sau phản ứng khuếch đại
Một trong những ưu điểm của kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn là dễ dàng nhận biết và phân tích sản phẩm khuếch đại. Nhiều phương pháp đa dạng đã được phát triển để đọc kết quả khuếch đại. Tính linh hoạt cao cho phép chúng ta lựa chọn phương pháp phù hợp với mục đích nghiên cứu và điều kiện cụ thể. Một số phương pháp nhận biết và phân tích sản phẩm sau phản ứng khuếch đại bao gồm.
Điện di trên gel
Phương pháp điện di trên gel phân tách các đoạn ADN dựa trên kích thước, qua đó xác định mức độ hiện diện và ước lượng kích thước sản phẩm khuếch đại.
Sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang
Trong quá trình khuếch đại, thuốc nhuộm huỳnh quang như SYBR Green hoặc dNTPs gắn chất phát huỳnh quang có thể được tích hợp vào sản phẩm. Khi thuốc nhuộm gắn vào ADN mạch đôi sẽ làm thay đổi cường độ huỳnh quang, do đó có thể theo dõi phản ứng theo thời gian thực và phát hiện trình tự đích.
Lai ghép với các đầu dò
Đầu dò đặc hiệu gắn với chất phát huỳnh quang hoặc các hạt nano (hạt nano vàng, hạt từ tính, chấm lượng tử) có thể lai với sản phẩm khuếch đại. Tín hiệu thu được từ các đầu dò này có thể xác định và định lượng sản phẩm khuếch đại.
Tín hiệu điện hóa
Tín hiệu điện hóa sử dụng các phân tử xen kẽ ADN (ví dụ xanh methylen) hoặc các chấm lượng tử để tạo ra tín hiệu điện hóa, qua đó phát hiện sản phẩm khuếch đại với độ nhạy cao.
Thay đổi màu sắc
Một số thuốc nhuộm có thể tạo ra thay đổi màu sắc khi gắn vào ADN, do đó có thể dễ dàng quan sát kết quả bằng mắt thường. Cách đọc kết quả này đặc biệt hữu ích cho các ứng dụng tại chỗ.
Phát quang hóa học
Phương pháp phát quang hóa học sử dụng enzyme horseradish peroxidase (HRP) hoặc các ADNzyme có hoạt tính tương tự HRP gắn với sản phẩm khuếch đại thông qua các đoạn ADN bổ sung, qua đó tạo ra tín hiệu phát quang hóa học có thể đo lường được.
Phát quang sinh học
Phản ứng khuếch đại vòng tròn lăn tạo ra lượng lớn pyrophosphat (ppi). Pyrophosphat này được sử dụng làm chất nền cho enzyme adenylyl transferase tạo ra ATP. ATP là cofactor cho enzyme luciferase tạo ra tín hiệu phát quang sinh học, qua đó cho phép phát hiện sản phẩm khuếch đại.
Ứng dụng của kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn
Chẩn đoán phân tử
Kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn mang lại hiệu quả vượt trội trong phát hiện và định lượng axit nucleic và protein. Trong lĩnh vực xét nghiệm lâm sàng, kĩ thuật này cho phép phát hiện mầm bệnh và các dấu ấn di truyền từ số lượng mẫu rất nhỏ, do đó có khả năng chẩn đoán nhanh các bệnh truyền nhiễm. Ngoài ra, phương pháp Immuno-RCA kết hợp giữa kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn với kĩ thuật miễn dịch đã nâng cao đáng kể độ nhạy và tính đặc hiệu. Vì vậy, phương pháp này có khả năng phát hiện protein có nồng độ thấp trong các mẫu sinh học phức tạp.
Nghiên cứu hệ gen và proteome
Trong nghiên cứu hệ gen, kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn rất quan trọng đối với khuếch đại các khuôn ADN vòng nhằm phục vụ cho các ứng dụng giải trình tự và xác định kiểu gen. Kĩ thuật này tạo ra số lượng lớn các trình tự ADN đặc hiệu để phân tích chuyên sâu. Trong lĩnh vực proteome, kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn được ứng dụng để tạo ra cảm biến sinh học dựa trên ADN. Các cảm biến này có khả năng phát hiện tương tác protein hoặc biến đổi sau dịch mã, qua đó góp phần làm rõ chức năng và con đường tín hiệu của protein.
Công nghệ nano
Kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn đã mở ra những hướng đi mới trong lĩnh vực công nghệ nano. Sản phẩm ADN sợi đơn dài được tạo ra từ kĩ thuật này có thể sử dụng làm khung giàn cho các hạt nano hoặc phân tử chức năng bám vào, qua đó tạo nên các cấu trúc phục vụ cho hệ thống vận chuyển thuốc hoặc tạo vật liệu nano. Ngoài ra, kĩ thuật này còn được sử dụng nhằm tạo ra cụm nano có cấu trúc tuần hoàn thông qua tổng hợp các trình tự ADN lặp lại, qua đó cải thiện đáng kể tính năng của vật liệu.
Phát hiện kim loại nặng
Kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn có thể phát hiện kim loại nặng trong môi trường nước. Phương pháp này có chi phí thấp và thao tác đơn giản, do đó khắc phục những hạn chế của các phương pháp truyền thống như sắc kí, quang phổ hay điện hóa vốn đòi hỏi thiết bị đắt tiền, phức tạp và cần người vận hành được đào tạo chuyên sâu.
Kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn được ứng dụng trong phát hiện thủy ngân—một kim loại độc hại cho sức khỏe con người. Nhiều phương pháp phát hiện thủy ngân được phát triển dựa trên kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn như cảm biến màu, cảm biến huỳnh quang để phát hiện thủy ngân với nồng độ cực thấp. Ngoài ra, kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn kết hợp với kĩ thuật đo màu được ứng dụng để tạo ra những bộ kit phát hiện nhanh, dễ sử dụng và có thể quan sát kết quả bằng mắt thường. Ứng dụng này rất quan trọng đối với giám sát và kiểm soát ô nhiễm kim loại nặng trong môi trường.
Các biện pháp cải tiến kĩ thuật
Khuếch đại vòng tròn lăn phân nhánh (Branched RCA)
Phương pháp khuếch đại vòng tròn lăn phân nhánh được thiết kế nhằm khuếch đại ADN hiệu quả hơn và tạo ra cấu trúc ADN phức tạp. Điểm khác biệt của phương pháp này so với kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn truyền thống là sử dụng thêm một đoạn mồi bổ sung gắn vào các sợi ADN mới được tổng hợp. Đoạn mồi này kích hoạt enzyme ADN polymerase tổng hợp các sợi ADN bổ sung dựa trên sản phẩm khuếch đại ban đầu, do đó hình thành các nhánh ADN mới song song với khuếch đại vòng. Kĩ thuật này làm tăng tốc độ khuếch đại và tạo ra các phức hợp ADN phân nhánh với kích thước lớn.
Phương pháp khuếch đại vòng tròn lăn phân nhánh có hiệu suất khuếch đại cao. Do đó, phương pháp này thường được ứng dụng trong các lĩnh vực như chẩn đoán phân tử, phát hiện ADN/ARN đặc hiệu hoặc tạo cấu trúc ADN phức tạp phục vụ công nghệ nano.
Đầu dò Padlock (Padlock Probes)
Đầu dò Padlock là một đoạn ADN ngắn được thiết kế hai đầu để có thể bắt cặp với các vị trí liền kề trên một trình tự ADN hoặc ARN mục tiêu. Khi hai đầu dò này gắn vào ADN hoặc ARN mạch khuôn, enzyme ADN ligase nối hai đầu lại với nhau để tạo thành một vòng ADN bền vững gắn liền với khuôn. Sau đó, kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn thực hiện phản ứng dựa trên khuôn ADN vòng này để tạo ra nhiều bản sao từ trình tự đích.
Ngoài ra, đầu dò Padlock có độ nhạy rất cao đối với sai lệch trong trình tự đích, một điểm khác nhỏ trên trình tự đích cũng có thể ngăn chặn quá trình hình thành vòng. Dựa vào đặc tính này, đầu dò Padlock được sử dụng nhằm phát hiện các đột biến gen hoặc nhận diện các trình tự ARN đích.
Ưu điểm
- Độ nhạy cao, có thể phát hiện phân tử mục tiêu với nồng độ rất thấp trong mẫu
- Tiết kiệm chi phí so với các phương pháp khuếch đại truyền thống
- Có khả năng phân biệt chính xác từng nucleotide đơn lẻ trong chuỗi ADN. Độ chính xác này rất quan trọng nhằm phát hiện đột biến và nghiên cứu biến thể gen
- Sản phẩm khuếch đại có thể sử dụng trực tiếp để giải trình tự sau khi xử lí phosphoryl hóa, đơn giản hóa quy trình thực nghiệm và tiết kiệm thời gian
Nhược điểm
- Chi phí tổng hợp đầu dò padlock khá cao
- Nhiễu nền trong quá trình phát hiện tín hiệu
Lời kết
Kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn là công cụ khuếch đại ADN tiềm năng và chúng đang dần phổ biến trong lĩnh vực sinh học phân tử. Kĩ thuật này có khả năng khuếch đại vượt trội cùng tính linh hoạt cao, do đó có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chẩn đoán bệnh, phát triển thuốc mới và khoa học vật liệu nano. Hiện nay, kĩ thuật khuếch đại vòng tròn lăn không ngừng được cải tiến để góp phần giải quyết những thách thức trong nghiên cứu khoa học và nâng cao chất lượng cuộc sống.